20世纪末，随着基因隐秘的揭开，人们开始尝试通过生物技术来改变生物的特性。1990年美国人纳波里利用转基因技术将一种催生红色素的CHS基因插入牵牛花中，期望得到更艳丽的花朵。但意想不到的事情发生了：牵牛花完全褪色，花瓣竟变成了白色！这个事例使人们产生了困惑。

　　与此同时，一些遗传学家着手在RNA的水平上进行结构基因功能的研究，想通过干预蛋白质的翻译过程或蛋白质的产量来分析基因的可能功能。他们采取了两类分析基因功能的方法，一类是用反义RNA封闭的RNA的功能，另一类则是通过RNA干扰使基因处于沉默状态。

　　反义RNA是指能与_mRNA互补配对的RNA分子，是相对DNA而言的。DNA是由方向相反的两条脱氧核苷酸链互补配对而成的，其中一条为正义链，另一条为反义链。具有编码功能的DNA分子就是基因，在指导_mRNA合成过程中，DNA的反义链作为模板，所转录出来的反义链的DNA而言就是正义链，因此能与mRNA互补结合的_mRNA分子就被称为反义RNA。

　　1995年美国康奈尔大学华人学者苏果在利用反义RNA阻断秀丽隐杆线虫par-1基因表达时未能出现预期的结果，反倒出现了正义RNA抑制基因表达的现象，从而敲开了RNA干扰技术的大门。

　　1998年华盛顿卡奈基研究院的遗传学家安德鲁·菲尔和马萨诸塞大学医学院的遗传学家克雷格·梅洛自行设计的结构基因功能实验首次证实：纳波里的牵牛花转基因实验的结果是基因沉默造成的，苏果的反义RNA实验的意外现象是由于污染微量双链RNA引起的。

　　菲尔和梅格创建的RNA干扰技术，来源于两类研究，一类是转基因结构的研究，另一类是反义RNA的研究。这种生物技术就是由短双链RNA诱导同源RNA的降解过程，可使特定基因的表达受到抑制，成为沉默基因。这种新的分子生物技术已成为转录后水平抑制基因表达的一种研究基因功能的有力工具，被当今世界认为在RNA水平上暂时关闭特定基因的最佳方法。

　　通过抑制或沉默基因表达对基因功能进行分析研究可以在RNA水平上进行，通过干预蛋白质的翻译过程或减少蛋白质的产量来分析基因的可能功能。目前在RNA水平上分析基因功能的方法主要有两类，一类是反义RNA封闭_mRNA的功能，另一类是RNA干扰转基因处于沉默状态。

　　两个获奖者精明地选择了双链RNA作为基因沉默的工具，成为这种创新分子生物技术成功的关键。双链RNA之所以能引起物特异性基因抑制是由于能激活细胞内的一种被称为Dicer的酶复合生物所致。Dicer是由核酸内切酸和解旋酶等组成，能识别异常双链RNA并将其切割成短链RNA，这种短链RNA可以与进一步被激活的Dicer结合成RNA诱导的沉默复合物(RISC)。RISC通过Dicer中解旋酶的作用将双链 RNA变成两个互补的单链RNA，然后单链RNA识别细胞内与其互补的靶RNA分子，并与之互补结合，这时Dicer中的核酸内切酶将RNA分子切断，从而使靶RNA分子失去编码蛋白质的功能。

　　RNA干扰过程主要有2个步骤：第一步，长双链RNA被细胞内的双链RNA特异核酸酶切成21～23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA；第二步，小干扰RNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RISC，该复合体可识别与小干扰RNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该_mRNA切断。

　　获奖者的研究发现，植物、线虫、动物和人的细胞中都存在无活性或低活性的Dicer，双链RNA是其激活剂，因此，人们利用合成的短双链RNA在RNA水平上抑制特定基因活性，就产生了一种RNA干扰技术，发挥RNA干扰作用的短双链RNA被称为小干扰RNA。由于正常细胞内不存在双链RNA，一旦出现双链RNA，细胞内Dicer就会被激活，因此RNA干扰可以被认为是机体的一种防御机制。如果病毒感染导致单链病毒RNA进入细胞时，虽然不能直接激活Dicer，但可以激活细胞内存在的一种RNA依赖的RNA聚合酶，被激活的聚合酶以病毒RNA为模板合成互补RNA链，从而产生双链RNA。因此，异常单链RNA可以间接激活Dicer而启动RNA干扰。

　　利用RNA干扰技术研究特定基因功能的主要程序包括：确定目标RNA并选择被干扰靶点，准备针对目标RNA的小干扰RNA，用这种RNA干扰目标RNA。在选择目标RNA干扰靶点时需要注意避开蛋白质结合部位。根据这种原则所设计的小干扰RNA有25%左右的可能性具有特异性干扰作用。合成小干扰RNA的方法有几种，最简单和最确实的方法是化学合成法，但价格太昂贵；体外转录法是一种比较便宜的方法，但整个操作均需避免RNA酶的污染而限制了其推广作用；体内转录法合成短双链发夹RNA是一种比较容易操作的方法，尤其将聚合酶链式反应（PCR）技术和体内转录结合起来更简单易行。无论采用哪种方法合成小干扰RNA，都需要将其导入细胞中，因此，小干扰RNA对目标RNA的干扰包括：小干扰RNA的转染和目标RNA含量或蛋白质表达水平的分析。

　　除使用人工合成的小干扰RNA之外，人们已经成功地使用发夹状RNA或以质粒载体或病毒载体在细胞内生成小干扰RNA，来特异性地抑制外源性或内源性基因在哺乳类动物或人细胞内表达。用质粒载体或病毒载体可在细胞内长时间、稳定地生成小干扰RNA。这些研究将有助于把RNA干扰技术用于治疗人类疾病。在大多数和哺乳类细胞做的RNA干扰实验中，双链RNA比单链RNA更有效。21世纪的分子生物技术——RNA干扰技术是一种广泛的体外基因失活或沉默的方法，是研究基因功能的一种公认的有效工具，也是快速评价基因功能或基因无效表型的直接工具。通过在一段时间内对一个RNA信号的抑制来研究基因的功能，进而开始描绘支配从细胞形态到生命信号系统的遗传网络。除了用RNA干扰技术研究一些关键基因的功能外，也有人在哺乳动物细胞中探索了用小干扰RNA在基因组水平上筛选基因的表达，可见，RNA干扰技术也正在成为筛选成百以至上千基因的工具。

　　在探索RNA干扰机制由来的过程中发现了内源性RNA干扰现象，生物体中有一群小分子RNA可通过自身的RNA干扰机制，在生命的各个阶段关闭或调控基因表达水平，从而控制细胞的多种生命活动。而发挥自身RNA干扰作用的小RNA分子很可能是以前被认为的“垃圾DNA”所编码。研究发现，有些RNA干扰现象在DNA编码不变的情况下传代，甚至在一些物种中对基因组进行调整。可见，RNA干扰途径已经不仅仅限于沉默，mRNA还作用于基因组。内部RNA干扰机制的可能功能包括：抗病毒作用，调控基因的表达，染色质的浓缩，转座子的沉默，基因组的重排等。

上一页  [1] [2] [3] 下一页